Data visar att fördelningen
av konfigurationer i lösning-

-moduleras av positivt selekterade
rester och mannosbindning.

I dag vill jag prata om den molekylära
grunden till värd-patogenförhållanden-

-och våra försök till nya behandlingar
som minskar antibiotikaanvändning.

Vi fokuserar på urinvägsinfektion
eftersom UVI är en varningsklocka-

-för antibiotikaresistenskrisen
som vi står inför.

Över 10 % av all antibiotika i USA
används mot UVI.

En följd är ökad multiresistens.
Vi närmar oss en brytpunkt.

Det förvärras av att kroniska patienter
får antibiotika i månader eller år.

Kateterassocierad UVI
ökar notan med en miljard dollar.

UVI orsakas oftast av E. coli-

-och alla UPEC
har bara 60 % gemensamma gener.

Stammar kan skilja sig åt med 40 %.

Huruvida stammen
orsakar en infektion hos patienten-

-hänger på det vår modell beskriver-

-om den givna stammens
urovirulensfenotyp-

-matchar med värdens
mottaglighetsfaktorer.

Dessutom trivs UPEC i olika miljöer:
tarm, urinblåsa, njure, vagina med mera.

Varje miljö har sina koloniseringskrav
som vi kallar "lås".

UPEC-stammar har olika fitnessfaktorer
som möjliggör kolonisering eller inte.

Vi kallar det "nycklar". Kolonisering
sker när ett lås öppnas av en nyckel.

Låsen kan förändras
av historia, genetik och beteende.

Komplexiteten beror alltså
på värd-patogenförhållanden.

Jag ska prata om fitnessfaktorer
som är viktiga i tarm och urinvägar.

Vi börjar med urinvägarna.

När bakterier kommer till urinblåsan-

-måste de få fäste,
och till det använder de pili.

Den genetiska basen för deras biogenes
beskrevs av Staffan Normark i Umeå.

En viss UPEC-stam kan koda fem till
sexton så kallade chaperonvägs-pili-

-eller CUP-pili. Vilka CUP det gäller
är olika från stam till stam.

Men alla bär på gener
som kodar typ 1-pili.

Typ 1-pili har en spets
med FimH-adhesin-

-som känner igen mannos
med stereokemisk specificitet.

Det visar sig att urinblåsan
är klädd med mannos.

Här ser ni en FimH-medierad
bakterievidhäftning i urinblåsan.

Här är den strukturella grunden
för mannosvidhäftningen.

Vidhäftningen aktiverar dynamiskt
cross talk i värd-patogen-förhållandet-

-vilket kan leda till zippering
på urinblåsecellerna-

-mellan FimH och mannosreceptorn.

När de väl tar sig in
aktiveras bakteriens utvecklingskaskad-

-och det bildas intracellulära
bakteriesamhällen, IBC.

Replikeringen är så robust att de får
paraplycellerna att skjuta ut i lumen.

Funktionen hos IBC-bildningen
avbildas i de här filmerna.

Ni ser här en urinblåsa infekterad med
GFP-taggad E. coli, och här är ett IBC.

Neutrofilerna är blåfärgade.

Neutrofilerna
försöker attackera bakterierna-

-men de kommer inte åt
de skyddade bakterierna.

Men här är bakterier
som inte hunnit samlas i IBC.

Då ser man att neutrofilerna inte har
några svårigheter att sluka bakterierna.

Så funktionen hos IBC-bildningen är att
ge bakterierna fotfäste och öka antalet.

De senaste årtiondena har vi studerat
"chaperon-usher"-maskineriet-

-och hur det bygger upp pili.

Chaperonen är
två immunoglobulindomäner.

Pili-subenheterna
är ofullständiga Ig-domäner.

Chaperonen binder till subenheterna för
att fullborda immunoglobulindomänen-

-vilket möjliggör veckning
av subenheterna-

-och koppling till en yttermembran-usher
så att en kanal bildas-

-genom yttermembranet
som gör att pili kan sammansättas-

-till sin slutgiltiga struktur.

Varje subenhet har en N-terminal-

-som fullbordar Ig-veckningen
på intilliggande pili.

FimH är ett 2-domänprotein. Veckningen
fullbordas av intilliggande subenheter.

Här visas FimH i grönt.

När domänerna binder till chaperonen
förlängs de.

Men när pili har bildats vrids
receptordomänen med 37,5 grader-

-i förhållande till pilindomänen.

Det intressanta är att vi har visat
att den förlängda, "relaxerade" formen-

-binder mannos med hög affinitet.

Men den kompakta, "spända" formen-

-som är den enda form jag har sett
med röntgenkristallografi-

-binder mannos med låg affinitet.

Det vi anade för flera år sen är att det
finns en jämvikt mellan formerna.

Vi ser tre positivt selekterade rester
utanför den mannosbindande fickan-

-och att de resterna modulerar
den konfigurationella jämvikten-

-och typen av rester
kan rucka jämvikten.

Den här allelen skjuter jämvikten
åt högaffinitetsformen.

Vasilios Kalas antog att den formen
då skulle vara relaxerad på spetsen.

Han kristalliserade allelen,
tittade på strukturen-

-och såg mycket riktigt
den relaxerade konfigurationen-

-men i en ny konfiguration kallad "böjd"
i förhållande till den förlängda.

Det ledde Vasilios till hypotesen-

-att relaxerad FimH kan prova
konfigurationella ensembler.

Med molekyldynamik
testade han hypotesen-

-och såg att den spända FimH
är relativt statisk-

-men att den relaxerade FimH kan prova
dynamiska konfigurationsensembler.

Han använde SAXS för att se skillnader
i form och storlek på FimH.

Jag ska bara sammanfatta. Rött betyder
olika strukturer. Blått är liknande.

De strukturer som är mest olika
är högaffinitetsformen-

-och lågaffinitetsformen.

Här borta ser ni skillnader i form
plus eller minus mannos.

Den variant med störst skillnader
i mannosbindning är den "vilda" typen.

Här ser ni avståndet
mellan adhesinatomerna.

När FimH binder till mannos
blir skillnaden störst-

-vilket överensstämmer
med att vild FimH bundet till mannos-

-föredrar den relaxerade
konfigurationen.

Data visar alltså att fördelningen
av konfigurationer i lösning-

-moduleras av positivt selekterade
rester och mannosbindning.

Den här bilden tog John Heuser
för tjugo år sen.

Jag har stirrat på den i tjugo år-

-och tänkt på det som en låsmekanism.
Så har jag sett på vidhäftning.

Nu vet vi att det inte är så. Bakteriell
bindning är en mer dynamisk process-

-där adhesinet låter bindningen
av bakterien till ytan-

-som kan öka bakteriens uppehållstid-

-och låta den absorbera vätska-

-och möjliggöra bakteriell bindning.

Modellen förklarar det jag har sagt.

Att det finns en dynamisk jämvikt.

Den vilda typen träffar mitt i prick.
Det finns "decoys" i urinvägarna.

Högaffinitetsallelen som binder mannos
visar sig kraftigt försvagad in vitro.

Vi tror att det är för att de binder
till decoys så att de inte når epitelet.

Lågaffinitetsvarianten
koloniserar för dåligt.

Högaffinitetsvarianten
elimineras av decoys.

Nu vill jag övergå till pilis roll
i slutreservoaren för UVI-

-och det är i mag-tarmsystemet. Det här
är studier gjorda av Caitlin Spaulding.

Hon har studerat
de olika CUP-pilis roll-

-och vad som gör att UPEC kan
upprätthålla reservoaren i tarmen.

Hon gjorde mutanter
i var och en av CUP-operonerna-

-och jämförde vild typ med mutanter.

I modellen behandlade hon
med streptomycin-

-och gav UTI89 oralt, vår UPEC-stam.

Som ni ser gick koloniseringen rätt bra
i alla olika vävnader.

Hon såg att två adhesiner var viktiga
för att upprätthålla tarmreservoaren.

Typ 1-pili
som också är viktiga i urinblåsan-

-men också F17-typen-

-som även kallas Ucl-pili.

Sen ville vi veta
var adhesinerna lokaliserar.

Var finns receptorerna de binder till?

Vi såg när vi tittade på FimH-lektinet
att de binder väl till övre kryptan.

PNGase-behandling som klipper
N-länkade oligosackarider-

-och förstör bindningen. Så FimH binder
N-länkade oligosackarider i kryptan.

Intressant nog binder Ucl-adhesinet
till de undre kryptorna.

O-glykosidas-behandling
upphäver bindningen-

-vilket tyder på att adhesinet binder
O-länkade oligosackarider i kryptan.

Det kan vara så att vid inflammation och
andra molekylära störningar i tarmen-

-frias nischer som UPEC kan inta
och dra ut dem ur mikrobiotan i lumen-

-till kryptan
där konkurrensen är mindre.

Det här är en hemsk bild,
men jag vill bara visa-

-att när man tittar
på F17-pilis fylogenes-

-är det begränsat
till E. coli utanför tarmen.

Den yttre ringen är olika CUP. De
inre ringarna är olika E. coli-klasser.

F17-typen tycks begränsad till B2-
stammar och stammar utanför tarmen.

En lika hemsk bild,
men bara för att visa.

F17-pili i blått som är begränsade
till E. coli utanför tarmen-

-är mest lika adhesiner
begränsade till tarmpatogener-

-som de F17-pili som finns i ETEC.

Så F17-typen av pili tycks ha utvecklats
ur enteriska patogener.

Som om UPEC har stulit adhesinet-

-för att upprätthålla sin tarmreservoar.

När vi jämför Ucl-adhesinet
med F17-adhesinet-

-har de mycket liten sekvenshomologi-

-men när vi bestämmer strukturen
för adhesinerna är de nästan identiska.

Vi känner till receptorbindningen för
F17, det binder till N-acetyl-glukos.

Det är en liknande ficka för UclD, men
vi vet ännu inte vilken receptorn är.

För att sammanfatta finns F17-pili bara
i 11 procent av alla E. coli-stammar-

-men i 50 procent av B2-stammarna.

I en klinisk studie med 14 patienter
där vi tog prover vid olika återfall-

-ett, två, tre återfall, och vi gjorde
en genomanalys av stammarna-

-såg vi att i återfall med samma stam-

-bar 91 % av återfallen
på F17-liknande pili.

Det tyder på att F17-pili
kan ha koppling till UPEC-

-och möjliggöra återkommande UVI
genom att främja tarmreservoaren.

Jag berättade om IBC-cykeln
i den akuta infektionsfasen.

Men den akuta cykeln
kan ha olika utfall.

Ett är att infektionen kan upplösas
med eller utan bildning av QIR-

-som kan ge upphov till nya infektioner.

Eller så kan infektionen
bli mer kronisk och återkommande-

-med ohämmad replikering i lumen.

Vi har försökt förstå vilka checkpoints
hos värden som avgör utfallet.

Den jag vill prata om nu är historia.

Det har länge varit känt
epidemiologiskt och kliniskt-

-att patienter med UVI-historia
löper större risk för UVI.

Vi ville veta varför, så vi tog fram
en modell för att undersöka-

-hur UVI-historia påverkar patogenes
för återkommande UVI.

Vi infekterar eller skeninfekterar
med PBS. De mössen kallar vi "naiva".

Eller så infekterades de med UTI89.

Hälften av mössen fick kronisk cystit
och ohämmad replikering i fyra veckor.

De mössen kallade vi "sensibiliserade".

Andra hälften med upphävd infektion
kallar vi "upphävda".

Vi behandlar med antibiotika,
väntar i fyra veckor och gör om det.

Det vi ser är
att de sensibiliserade mössen-

-är signifikant mer infektionsbenägna
jämfört med de naiva och upphävda.

En anledning som jag ska visa
är att urinblåsan har omformats-

-av sensibiliseringsprocessen,
och det märks morfologiskt.

Ni ser bilder på urinblåsor från naiva,
sensibiliserade och upphävda möss-

-efter antibiotikabehandling
och fyra veckors vila.

Luminalcellerna på de sensibiliserade
mössen är 21 gånger mindre-

-än på de naiva mössen.
Här har vi färgat basalcellsmarkörer.

I lila ser man en utökad proliferativ
zon hos de sensibiliserade mössen.

Om man färgar markörer
för terminaldifferentiering-

-där markörerna är vita-

-saknar de sensibiliserade mössen det
jämfört med de naiva.

Så sensibiliseringen tycks skapa
en defekt i terminaldifferentiering.

Vi gjorde också proteomanalys
och RNA-sekvensering på urinblåsorna.

Vi ser hundratals gener
som är differentiellt reglerade.

Vi gör pathway-analys som tyder på att
de sensibiliserade urinblåseepitelen-

-är känsligare för neutrofilskador
till följd av inflammationen.

Det märks på elektronmikroskopbilderna
att när en sensibiliserad blåsa utmanas-

-blir inflammationsreaktionen
översvallande.

Nu blir neutrofilerna skurkar-

-och läget blir perfekt
för ohämmad bakteriereplikering.

Sensibilisering från tidigare infektion
leder till en omformning-

-som ökar sårbarheten
för senare infektion.

Här är data. I mitten utmanar vi naiva
och sensibiliserade möss med tre isolat.

I varje fall ser man att sensibiliserade
möss är benägna till svårare UVI-

-jämfört med de naiva mössen.

Vi ser samma sak
i andelen möss som får kronisk cystit.

För det första är de naiva mössen
nästan resistenta mot kronisk cystit.

Men av de sensibiliserade mössen
får upp till 80 procent kronisk cystit.

Infektionskinetiken är intressant.

Möss med infektionshistoria
är resistenta mot IBC-bildning.

När vi tittar på CFU
efter 6 och 12 timmar-

-har sensibiliserade och upphävda möss
en koloniseringsresistens.

Men efter 24 timmar
händer nåt intressant.

Resistensen bryts ner. En andel
av mössen får svårare cystit-

-ett dygn in i den akuta cykeln.

Vad är det för checkpoint som leder
till genombrottet för koloniseringen?

Den viktigaste faktorn vi har upptäckt
hittills är COX-2-uttrycket.

Hos de sensibiliserade mössen är det ett
ökat COX-2-uttryck med direkt koppling-

-mellan CFU och COX-2-uttrycket,
liksom PMN-värdet.

In situ-färgningen visar att COX-2-
uttrycket är robust i urinblåseepitelet.

COX-2 är ett enzym som omvandlar
arakidonsyra till prostaglandin.

Prostaglandin binder till olika
receptorer och modulerar inflammation.

Därför är det en perfekt plats
för farmakologisk intervention.

NSAID-preparat är COX-2-hämmare.

Vi undrade om modulerande behandling
kan påverka återkommande UVI.

Det vi ser är slående. Efter 24 timmar
har möss som fått COX-2-hämmare-

-signifikant minskad pyuri
sett till PMN-värde.

Och de skyddas mot återkommande UVI
jämfört med skenbehandlade möss.

Skälet till det verkar vara-

-att COX-2 tillåter PMN
att migrera genom epitelet.

Hos de skenbehandlade mössen
kan PMN migrera genom epitelet-

-vilket leder till slemhinneskador.
COX-2-hämmare skyddar mot det.

Då kan vävnaden nybildas
och skydda sig mot återkommande UVI.

Det gjordes en klinisk studie på det här
för några år sen.

Den gjordes på 71 kvinnor med UVI.

Hälften fick NSAID
och hälften ciprofloxacin i fyra dagar.

Det kliniska utfallet var identiskt.

Det tyder på att NSAID
inte bara maskerar symtomen-

-utan att de också
förändrar infektionsförloppet.

För att sammanfatta har vi identifierat
ett molekylärt avtryck-

-på urinblåsan efter en infektion-

-som gör värden mottaglig
för återkommande infektioner-

-på grund av förändrat transkriptom,
säkert epigenetiska förändringar-

-och COX-2-hämmare
kan skydda mot det.

Det är spännande, för den upptäckten
skulle kunna tillämpas direkt-

-och hjälpa patienter.

Jag har pratat om hur värden
anpassar sig till infektioner.

Jag ska visa hur adhesiner också
anpassar sig, särskilt Fml-adhesinet-

-som inte binder till naiv vävnad,
bara till inflammerad vävnad-

-vilket tyder på en receptor
som uttrycks vid inflammation-

-som adhesinet har anpassats till.

Vi har identifierat adhesinet
som Tf- och Tn-antigen.

För att titta på vilken receptor
som uttrycks i njuren-

-har vi använt PNA- och HPA-färgning
på Tf- respektive Tn-antigen.

Den naiva vävnaden färgas inte, men
i den inflammerade syns Tn-antigen-

-som överlappar med FmlH-färgningen.

Det försvinner helt med behandling
med N-acetylgalaktosaminidas.

Det upphäver både FmlH-bindningen
och HPA-färgningen-

-vilket tyder på att det är Tn-antigenet
som E. coli-adhesinet binder till.

Fml ger en fördel i konkurrensen
mellan vild typ och Fml-mutanter.

Den vilda typen vinner. Vi har löst
strukturen för Fml på Tf-antigen.

Om vi tittar på proteomet kan vi se-

-att galaktosyltransferaserna
uppregleras liksom Fml-operonen.

Det är en sorts yin och yang.
FimH är viktigt i naiv vävnad-

-men vid inflammation uttrycks
en ny receptor som FmlH utnyttjar.

Om vi tittar på hur upptäckterna på möss
kan tillämpas för kvinnor-

-upptäcks IBC även hos kvinnor, och
serumcytokiner är liknande hos kvinnor.

Omformningen ser vi även hos patienter
med återkommande infektioner.

Sjukdomsspektrumet är liknande,
och även betydelsen av historia.

Jag vill avsluta med hur vi försöker
överföra de vetenskapliga framstegen-

-till nya antibiotikabesparande
behandlingar.

Antibiotikaresistensen ökar som sagt
fort. Vi närmar oss en brytpunkt-

-och vi behöver
antibiotikabesparande behandlingar.

Bara i USA skrivs
över 10 miljoner recept ut årligen.

Det största användningsområdet för
fluorokinoloner är behandling av UVI.

Med den vetskapen försöker vi hitta
antibiotikabesparande medel.

Jag ska ta upp några av dem. Här är
min bästa vän i Umeå, Fredrik Almqvist.

Han är inte bara skicklig älgjägare,
utan också en fantastisk kemist.

Han har utformat molekyler-

-som dödar chaperon-usher-maskineriet
och stoppar pili-sammansättningen.

Med Matt Chapman har han även
utvecklat curlicider mot amyloidfibrer.

De molekylerna
har stor terapeutisk potential-

-för både grampositiva och -negativa
organismer.

Vi har utvecklat ett FimH-vaccin
som fas 1-prövas.

Det har godkänts av FDA för patienter
med multiresistenta infektioner.

Vi utvecklar också mannosider-

-som imiterar mannos med binder
till FimH en miljon gånger starkare.

På så sätt blockerar molekylerna
bakteriell bindning i urinblåsan.

Vi arbetar med GSK
på det här projektet.

Vi har rationellt designat
tusentals föreningar-

-med hopp om klinisk prövning fas 1
på den bästa.

Hos möss är de oralt biotillgängliga och
potenta profylaktiskt och i behandling.

Här behandlas möss med kronisk cystit
oralt med en viss mannosid.

Efter sex timmar
sker en signifikant 4-log reduktion.

Fler behandlingar
eliminerar infektionen.

Molekylerna är snabbare än antibiotika,
för deras verkningsmekanism är direkt.

Så fort de binder
släpper bakterien från vävnaden.

Multiresistenta stammar
går bra att behandla med mannosider.

Jag ska avsluta med nåt spännande.

Som sagt är tarmen
UPEC:s slutreservoar.

Så vi undrade
om mannosider kan utrota reservoaren.

Här är modellen igen med streptomycin,
UTI89 och tre mannosidbehandlingar.

Behandlingen visar sig reducera UPEC-
koloniseringen i tarmen med över 98 %.

Mannos i sig har ingen effekt. Det krävs
potenta analoger med hög affinitet.

Om vi tittar på mikrobiomstrukturen
lämnar mannosiden strukturen intakt.

Till skillnad från ciprofloxacin som
helt förändrar mikrobiomstrukturen-

-har mannosidbehandling
ingen eller liten effekt.

Så vi tror att vi har
en molekylär skalpell.

Mannosiderna kan avlägsna
reservoaren från tarmen-

-och lämna mikrobiomstrukturen intakt.

Vi tror att det finns en chans att snart
kunna göra kliniska prövningar.

Där ska jag avsluta.

Vi får höra här om alla olika bakterier
och hur de alstrar sjukdomar-

-men nästan alla mikrobiella patogener-

-måste nån gång under sin cykel
binda till en cell eller yta.

Vi vill revolutionera behandlingen av
infektioner i värd-patogen-gränssnittet-

-för att få antibiotikabesparande
behandlingar.

De personer som har gjort arbetet
visas här.

Särskilt tack till Jeff Gordon
för mikrobiotastudierna.

Tom Hannan och Valerie O'Brien-

-har jobbat med urinblåseomformning-

-och Caitlin Spaulding har jobbat
med tarmkoloniseringsmodellen.

Tack så mycket.

Översättning: Erik Swahn
www.btistudios.com